水產(chǎn)品中漁藥殘留限量

……（A.1）
式中：
E——吸光度值，%；
A——標(biāo)準(zhǔn)或樣品的吸光度值；
A0——0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值。
以計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)值繪成一個(gè)對應(yīng)氯霉素濃度（ng/L）的半對數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)曲線圖，校正的曲線在50 ng/L～1 350 ng/L的范圍內(nèi)應(yīng)成為線性，相對應(yīng)的每一個(gè)樣品的濃度，可以從曲線上讀出。乘出稀釋倍數(shù)即可得到樣品中氯霉素的實(shí)際濃度（ng/kg）。
 
附 錄 B
（規(guī)范性附錄）
己烯雌酚（DES）殘留的酶聯(lián)免疫測定法
B.1 適用范圍
本方法適用于測定水產(chǎn)品肌肉等可食組織中己烯雌酚的殘留量。
B.2 原理
測定的基礎(chǔ)是利用抗體抗原反應(yīng)。微孔板包被有針對兔IgG（DES抗體）的羊抗體，加入DES抗、標(biāo)準(zhǔn)和樣品溶液。DES與DES抗體連接，同時(shí)DES抗體與羊抗體連接。洗滌步驟后，加入DES酶標(biāo)記物，DES酶標(biāo)記物與孔中未結(jié)合的DES抗體結(jié)合，然后在洗滌步驟中除去未結(jié)合的DES酶標(biāo)記物。將酶基質(zhì)和發(fā)色劑（四甲基聯(lián)苯胺）加入到孔中并孵育；結(jié)合的酶標(biāo)記物將無色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)停止液后使顏色由藍(lán)變?yōu)辄S，在450 nm處沒量，吸光度與樣品的己烯雌酚濃度成反比。
B.3 檢測限
己烯雌酚檢測的下限為1mg/kg。
B.4 儀器
B.4.1 微孔酶標(biāo)儀（450 nm）。
B.4.2 離心機(jī)。
B.4.3 37℃恒溫箱。
B.4.4 移液器。
B.4.5 50mL，100mL，450mL微量加液器。
B.4.6 RIDA C18柱等。
B.5 試劑和標(biāo)準(zhǔn)溶液
除非另有說明，在分析中僅使用確認(rèn)為分析純的試劑和蒸餾水或去離子水或相當(dāng)純度的水。
B.5.1 叔丁基甲基醚。
B.5.2 石油醚。
B.5.3 二氯甲烷。
B.5.4 6 mol/L磷酸。
B.5.5 乙酸鈉緩沖液等。
B.5.6 提供的DES標(biāo)準(zhǔn)液為直接使用液，濃度為0、12.5×10–9mol/L、25×10–9mol/L、50×10–9mol/L、100×10–9mol/L、200×10–9mol/L。
B.6 樣品處理
B.6.1 取5.0 g肌肉（除去脂肪組織），用10 mL pH為7.2的67 m mol/L磷酸緩沖液研磨后，用8 mL叔丁基甲基醚提取研磨物，強(qiáng)烈振蕩20 min；離心10 min（4 000 r/min）；移去上清液，用8 mL叔丁基甲基醚重復(fù)提取沉淀物。
B.6.2 將兩次提取的醚相合并，并且蒸發(fā)；用1 mL甲醇（70%）溶解干燥的殘留物；用3 mL石油醚洗滌甲醇溶液（研磨15 s，短時(shí)間離心，吸除石油醚）。
B.6.3 蒸發(fā)甲醇溶液，用1 mL二氯甲烷溶解后，再用3 mL 1 mol/L的氫氧化鈉（NaOH）溶液提�。蝗缓�300 mL 6 mol/L磷酸中和提取液，用RIDA C18柱進(jìn)行純化。
B.7 測定程序（室溫20℃～24℃條件下操作）
B.7.1 將足夠標(biāo)準(zhǔn)和樣品所用數(shù)量的孔條插入微孔架，標(biāo)準(zhǔn)和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，記錄下標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置。
B.7.2 加入20mL的標(biāo)準(zhǔn)和處理好的樣品到各自的微孔中，標(biāo)準(zhǔn)和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。
B.7.3 加入50mL稀釋后的DES抗體到每一個(gè)微孔中，充分混合并在2℃～8℃孵育過夜（注意：在第二早上繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前，微孔板應(yīng)在室溫下放置30 min以上，稀釋用緩沖液也應(yīng)回到室溫，因此最好將緩沖液放在室溫下過夜）。
B.7.4 倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打（每行拍打3次）以保證完全除去孔中的液體，用250mL蒸餾水充入孔中，再次倒掉微孔中液體，再重復(fù)操作兩次。
B.7.5 加入5mL稀釋的酶標(biāo)記物到微孔底部，室溫孵育1 h。
B.7.6 倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打（每次拍打3次）以保證完全除去孔中的液體，用250mL蒸餾水充入孔中，再次倒掉微孔中液體，再重復(fù)操作一次。
B.7.7 加入50mL基質(zhì)和50mL發(fā)色試劑到微孔中，充分混合并在室溫暗處孵育15 min。
B.7.8 加入100mL反應(yīng)停止液到微孔中，混合好在450 nm處測量吸光度值（可選擇＞600nm的參比濾光片），以空氣為空白，必須在加入停止液后60 min內(nèi)讀取吸光度值。
B.8 結(jié)果
所獲得的標(biāo)準(zhǔn)和樣品吸光度值的平均值除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值再乘以100，得到以百分比給出的吸光度值，以式（B.1）表示：
……（B.1）
式中：
E——吸光度值，%；
A——標(biāo)準(zhǔn)或樣品的吸光度值；
A0——0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值。
以計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)值繪成一個(gè)對應(yīng)DES濃度（ng/L）的半對數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)曲線圖，校正的曲線在25 ng/L～200 ng/L的范圍內(nèi)應(yīng)成為線性，相對應(yīng)的每一個(gè)樣品的濃度，可以從曲線上讀出。乘以稀釋倍數(shù)即可得到樣品中DES的實(shí)際濃度（ng/kg）。