國外一項新發現，可使對蝦養成率提高到85%

     根據一份來自越南胡志明市的AquaMekong Shrimp Vet實驗室和比利時Nutriad International公司聯合撰寫的報告顯示，飼料添加劑有助于減輕早期死亡綜合征對于對蝦的影響。


    據悉，早期死亡綜合征（EMS）在科研領域更為常見的名稱是急性肝胰腺壞死病（AHPND）,這種新型的蝦病目前集中爆發于中國、泰國、越南和墨西哥等對蝦主要養殖地區。由于引起對蝦發病的副溶血弧菌菌株的特異性，致使這種病原體很難從環境中根除，因此對于AHPND，亟需一種生物安全策略去抵抗目前EMS肆虐的情況。






    研究表明，在微生物的作用下，通過初期對親體和幼體進行持續干預避免早期污染對防治EMS至關重要。為了控制弧菌發展在養殖過程中使用任何抗生素都是不可取的，因為一旦使用抗生素就意味著要承擔產生生物抗性以及被立法者與消費者抵制的風險，因此如今的對蝦產業正在尋求一種替代方式去調控生產過程中的微生物系統。


    其中，可持續調節對蝦腸道微生物系統的方法包括使用益生菌、有機酸、酵母提取物以及其它可以使菌株產有益物質的天然化合物。這些化合物之間的協同反應將對對蝦腸道產生有益作用，例如天然化合物可以強化益生菌系統，從而提高在生產過程中接種益生菌的效果。


    此外，富含促進腸道健康因子的功能性飼料能夠每天為對蝦腸道提供足夠濃度的天然抗菌肽。這樣類型的飼料在任何治療EMS病癥的方案里都是關鍵。值得注意的是，防治EMS的方法能否成功取決于用來對抗病原菌的腸道健康促進因子效力的大小。理想的飼料添加劑應該是熱穩定的，這樣飼料廠在后期加工時可以很方便地添加到飼料中。


    天然飼料添加劑的不同組合針對弧菌有不同作用機制，諸如使用直接殺菌劑、抑菌劑或者群體活性抑制劑等在低于MIC濃度（最小抑菌濃度）下，是處理EMS時最有效的組合。在現階段的實驗中，主要評估的是一種對實驗室AHPND弧菌感染力減輕的效果，以及使用三種不同種類的健康飼料添加劑所表現出的具體效力，而主要檢測的是這種弧菌對對蝦消化系統的感染情況，同再次感染發生后2周之內對蝦的死亡率。


實驗情況


    此次富有挑戰性的跟蹤實驗是在越南胡志明市的AquaMekong對蝦實驗室（MPA）中進行。實驗人員在21天前，用前文提到的三種飼料添加劑（編者注：即后面提到的SANACORE、PHYTO和OAC）混合到對蝦的食物中，用來飼喂南美白對蝦。


    實驗前的準備工作是，將12天大小的對蝦（SPF，SIS親蝦）在生物安全系數極高的環境中培養45天到其重量達1-2g的時候可以轉移到實驗環境中。在實驗開始的一天前，南美白對蝦被轉移到90L的培養箱內。每天都對試驗箱中的對蝦投喂其體重5%的實驗飼料。值得注意的是，所有的實驗水族箱都裝備有牡蠣殼過濾器、通風裝置并用塑料膜覆蓋以減少被污染的風險。


    實驗中，將混合有上述三種具有微生物抗性飼料添加劑的飼料和未添加任何其它成分的普通飼料進行比較發現：1、SANACORE是一種高效融合多種抑菌劑以及菌群抑制劑的天然抗菌化合物；2、PHYTO是一種植物性的抗菌混合劑；3、OAC是一種有機酸混合物。


實驗方法


    MAP和亞利桑那大學的水產養殖實驗室合作研發了多種極具挑戰性的試驗方法，通過模擬自然感染條件，來觀察幼蝦應對因副溶血弧菌引起的EMS/AHPND（感染主要是通過水媒傳播以及同類相食）。


    在這項研究中，主要使用兩個方法：一個是（細菌）水浸沒法，另一個是直接注射（細菌）法。


    水浸沒實驗方法：使用胰蛋白酶大豆肉湯+2%的氯化鈉溶液+副溶血弧菌菌株，在28℃的環境下培養18個小時之后，直接加入到罐中使整體溶液的光密度達到3.105個細胞/ml（譯者注：OD600為3.105即細菌濃度已達到飽和狀態）。


    直接注射實驗方法：在TSB 培養液上接種LA37副溶血弧菌菌株并保溫18個小時，加入20%的對蝦飼料并在空氣中干燥15分鐘，最后為對蝦直接注射這種處理過的飼料，飼料的重量大約在對蝦體重的3%左右。

實驗室的實驗裝置

    另外，設置對照組，對照組同樣飼喂相同飼料，不同的是使用無菌TSB培養基來代替細菌懸浮液。在實驗開始的一天前，設置0號實驗組用于記錄WSSV、TSV、EMS/AHPND以及IMNV等動物的亞健康狀態，用于之后區別EMS引起的發病率及死亡率。每組實驗中，在電鍍到用于計數的不同媒介金屬板上之前，瓊脂培養基上的弧菌總數要在5日、10日、15日分別進行一次稀釋，最后將實驗對蝦剝殼打成勻漿后并在鹽水中連續地稀釋。過程中，每天檢查兩次實驗裝置，發現死亡樣品之后及時將其從實驗裝置中取出冰凍處理用于之后的PCR，要在每一個實驗組中取出3個垂死的樣本保存在AFA固定劑中，使用常規組織學方法處理，并最中PCR確認EMS/AHPND的病理真實存在。所有實驗都結束之后，凡是仍然存活（無論活躍程度）的樣本都算作該實驗幸存樣本。


結果與討論


    經組織學分析表明，陰性對照組在整個實驗過程中蝦體都保持著EMS陰性狀態。同時，在其它陽性實驗組中則表現出了EMS病變癥狀。讓人感到有趣的是，在所有EMS呈陽性的組里，實驗開始5天和10天的兩組對蝦感染EMS嚴重，但是在實驗開展15天的實驗組里并沒有發現很嚴重的EMS病癥出現。這項實驗結果表明了對蝦有可能在感染了EMS之后重新恢復健康狀態，但前提是它們可以在與EMS的對抗中幸存下來。


    實驗中，陰性對照組中對蝦的存活率高達91%，這表明在整個實驗中所使用的對蝦處于健康、營養良好的狀態。除此之外，此過程里對蝦死亡集中在實驗進行到15天的時候，這是由于選擇了毒性中等的弧菌菌株所致（圖1）。

    圖1：實驗進行的15天內，樣品對蝦面臨兩種感染方式的威脅，具體程度如圖，分別是陰性對照組（黃色），陽性對照組（紅色）以及陽性組中飼料分別加入不同添加劑（SANACORE藍色；PHYTO綠色；OAC紫色）。然而，在水浸沒法感染實驗中使用添加劑組的對蝦死亡會減緩，但在直接注射感染法中，鮮有這種現象發生。陽性組中，水浸沒法和直接注射法的存活率分別為15.6%和26.7%。


    圖2：三種飼料添加劑中，在陽性對照組死亡率的基礎上，相比較SANACORE的存活率最高，在水浸沒和直接注射感染中蝦的成活率分別為+107%和+62%；PHYTO僅在水浸沒感染法中表現出較高的成活率，具體為+135%；OAC在兩個不同的感染方式中成活率之間沒有明顯區別。 




   

 圖3：圖表顯示的是實驗中通過兩種感染方式處理，三種不同的添加劑最終導致對蝦消化系統中的弧菌總數。其中第0天顯示的是實驗開始前已經用不同的飼料喂養21天之后的樣品數據。值得注意的是，同對照組相比，較低弧菌水平的樣品組在21天的喂養中已經建立了穩定的吃食習慣。 

    該實驗結果與來自受EMS影響嚴重的墨西哥、越南等地農場的田間試驗結果一致，即飼料添加劑可以使對蝦受EMS影響的成活率從60%-70%提高到85%。然而廣大養殖戶應該明白的是，飼料添加劑在解決EMS影響方面并不是絕對有效的方式，更多的需要做好養殖管理。